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摘要:感染?休克?心臟大手術(shù)以及腎移植過程中腎臟均會遭遇缺血再灌注(ischemia/reperfusion,IR)的情況,造成急性腎臟損傷(acutekidneyinjury,AKI)?而部分AKI患者會進(jìn)展為慢性腎臟病(chronickidneydisease,CKD),甚至?xí)l(fā)展為終末期腎功能衰竭(endstagerenaldisease,ESRD),極大影響患者的生存質(zhì)量和生活質(zhì)量?IR引起腎臟損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜,涉及到體內(nèi)多個系統(tǒng)?多種因素?多個通路的共同作用,而現(xiàn)有預(yù)防和治療IR引發(fā)急慢性腎損傷的藥物和方案并未達(dá)到理想的效果?重組人ADAMTS13(recombinanthumanadisintegrinandmetalloproteasewiththrombospondinmotifs13,rhADAMTS13)可用于血栓性血小板減少性紫癜患者的治療,減輕患者急性腎功能損傷?因此,rhADAMTS13可否用于其他原因引發(fā)腎臟病的治療引起我們的注意?既往臨床研究證實血管性血友病因子(vonWillebrandfactor,VWF)/ADAMTS13比例增高及ADAMTS13的活性降低與腎功能的下降密切相關(guān)?動物實驗提示ADAMTS13除具有抗微血管血栓形成用于延緩糖尿病腎病的治療外,也具有抗炎的作用,可用于治療缺血性腦損傷和心肌缺血再灌注損傷?因此該實驗建立IR引發(fā)急慢性腎損傷的動物模型,觀察腎臟AKI及CKD時期VWF和ADAMTS13的表達(dá);且以rhADAMTS13外源性給藥的方式,觀察rhADAMTS13對IR引發(fā)急慢性腎損傷的作用,并且進(jìn)一步探討該藥物發(fā)揮作用的機(jī)制,為該藥物可否作為臨床AKI及CKD患者的治療性用藥,及其可否用于治療類似機(jī)制的其他疾提供一定的實驗基礎(chǔ)?第一部分:腎臟缺血再灌注不同階段VWF/ADAMTS13的表達(dá)及其與氧化應(yīng)激水平的相關(guān)性研究目的:構(gòu)建IR小鼠模型,探究再灌注后不同時間點VWF?ADAMTS13表達(dá)的改變?并且進(jìn)一步分析VWF?ADAMTS13的表達(dá)與機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥因子的相關(guān)性?方法:1)雙側(cè)腎臟缺血后恢復(fù)灌注建立IR模型?復(fù)灌后不同時間點收集小鼠血液?尿液及腎組織?2)檢測小鼠腎功能?氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)和24小時尿液中蛋白及ADMATS13含量?3)檢測小鼠血漿VWF?ADAMTS13水平及腎組織VWF及ADAMTS13mRNA表達(dá)?結(jié)果:1)缺血20分鐘,復(fù)灌24小時及48小時后血清肌酐(serumcreatinine,Scr)?尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)和24小時尿蛋白較sham組顯著增加?缺血18分鐘恢復(fù)灌注術(shù)后3月后BUN和Scr較sham組增加?IR后不同時間點小鼠血漿VWF水平增高,ADAMTS13下降,VWF:ADAMTS13比值增加,尿ADAMTS13流失增加?2)IR后不同時間點小鼠丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平增加,血漿腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)水平增加,超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活性下降,尿過氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2)增多?3)血漿VWF:ADAMTS13比值與MDA,TNF-α呈正相關(guān),與SOD?CAT活性呈負(fù)相關(guān)?血漿VWF:ADAMTS13比值與尿蛋白含量顯著呈正相關(guān)?結(jié)論:該研究表明,IR可誘導(dǎo)AKI和CKD?IR后不同階段血漿VWF:ADAMTS13比值增高且伴隨氧化應(yīng)激?炎癥反應(yīng)的激活?VWF:ADAMTS13比值與氧化應(yīng)激?TNF-α及尿蛋白水平成正相關(guān),與抗氧化應(yīng)激酶類活性呈負(fù)相關(guān)?第二部分:rhADAMTS13對缺血再灌注引發(fā)急性腎損傷的保護(hù)性作用及機(jī)制研究目的:探討外源性給予人源重組ADAMTS13(RecombinanthumanADAMTS13,rhADAMTS13),是否可減輕IR引發(fā)AKI及其保護(hù)性作用的機(jī)制?方法:1)雙側(cè)腎臟缺血20分鐘,構(gòu)建AKI模型?術(shù)前半小時給予不同劑量rhADAMTS13或者術(shù)后半小時給予rhADAMTS13(2.6μg/kg)尾靜脈給藥?復(fù)灌24小時?48小時后收集小鼠血液?組織標(biāo)本檢測相關(guān)指標(biāo)?2)試劑盒檢測血清BUN?Scr,ELISA檢測腎損傷因子(kidneyinjurymolecule-1,KIM-1),胱抑素C(cystatinC,CysC),中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutropilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)及RT-qPCR檢測腎組織KIM-1,NGALmRNA表達(dá)?3)PAS染色及免疫組化檢測小鼠腎組織病理損傷的程度及凋亡小管上皮細(xì)胞的數(shù)量?4)檢測氧化應(yīng)激相關(guān)分子?術(shù)前給IR小鼠超氧化物歧化酶類似物(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinoxyl,tempol)50mg/kg腹腔注射作為陽性對照組進(jìn)一步確定ADAMTS13的保護(hù)性作用,觀察tempol是否可減輕IR誘導(dǎo)AKI?術(shù)后同時給予IR小鼠rhADAMTS13(2.6μg/kg)和VWF(80μg/kg),檢測小鼠氧化應(yīng)激及腎功能相關(guān)指標(biāo)?探究rhADAMTS13在AKI中的保護(hù)性作用是否依賴于VWF?5)檢測小鼠炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo),探究rhADAMTS13是否具有抑制IR小鼠炎癥反應(yīng)的作用及其分子機(jī)制?IR小鼠術(shù)前腹腔注射過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorγ,PPARγ)抑制劑GW9662(2mg/kg)驗證細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)/PPARγ通路是否參與rhADAMT13對AKI的保護(hù)性作用?6)采用在體靜脈給予乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)或者硝普鈉(sodiumnitroprusside,SNP)觀察血壓改變趨勢及體外顯微微灌注技術(shù)比較小鼠腎小球入球動脈對ACh/SNP的血管反應(yīng)性評價微血管內(nèi)皮功能?建立入球小動脈體外缺氧復(fù)氧模型(hypoxia/reoxygenation,H/R),孵育rhADAMTS13(3750pg/ml)30分鐘,后檢測入球小動脈對ACh/SNP的血管反應(yīng)性評價微血管內(nèi)皮功能?7)采用熒光探針法檢測顯微微灌注的小鼠腎小球入球動脈中熒光信號,評估入球小動脈一氧化氮(nitricoxide,NO)和活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)的表達(dá)?分別采用內(nèi)皮型一氧化氮合酶抑制劑(NG-Nitro-L-arginineMethylEster,Hydrochloride,L-NAME),tempol和H2O2預(yù)孵育體外灌注的入球小動脈,后觀察血管對于ACh誘導(dǎo)舒張的反應(yīng)?8)Westernblot檢測小鼠腎組織Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)磷酸化激活的水平?rhADAMTS13治療IR小鼠同時尾靜脈注射Akt通路抑制劑Wortmannin(50nmol/kg),檢測腎結(jié)構(gòu)和功能改變及血管內(nèi)皮功能,探究rhADAMTS13對血管內(nèi)皮功能的改善是否依賴于Akt/eNOS通路?結(jié)果:1)rhADAMTS13治療可抑制IR小鼠腎組織VWF表達(dá)增多?ADAMTS13表達(dá)下降,改善腎組織ADAMTS13異常分布?2)rhADAMTS13降低IR小鼠BUN?Scr及尿蛋白水平的增加,抑制小管上皮細(xì)胞的壞死和凋亡?同氧自由基清除劑tempol—樣可保護(hù)腎臟減少IR誘導(dǎo)AKI?3)rhADAMTS13上調(diào)核因子E2相關(guān)因子(Nuclearfactor-erythroid-2-relatedfactor2,Nrf2)/血紅素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)水平,增加IR小鼠抗氧化應(yīng)激酶類的活性,抑制ROS和MDA的產(chǎn)生?4)rhADAMTS13抑制IR小鼠p38/ERK/環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)/前列腺素E2(ProstaglandinE2,PGE2)的激活,上調(diào)PPARγ的表達(dá),抑制IR引起炎癥因子的增多和炎性細(xì)胞的浸潤?rhADAMTS13治療IR小鼠同時給予GW9662,與僅給rhADAMTS13治療IR小鼠相比,GW9662會升高小鼠血清BUN?Scr的水平,加重小管損傷,損傷入球小動脈對ACh誘導(dǎo)血管舒張反應(yīng)?5)監(jiān)測血壓同時靜脈給予ACh/SNP,結(jié)果顯示四組小鼠基礎(chǔ)血壓無明顯差異?但I(xiàn)R小鼠給予ACh,血壓下降幅度較sham組減小,而rhADAMTS13可改善這一現(xiàn)象?四組小鼠SNP引起血壓下降的幅度無明顯差異?rhADAMTS13抑制IR引起的入球小動脈ROS的增多,抑制氧化應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能障礙?同時rhADAMTS13可抑制IR引起的Akt/eNOS通路的下調(diào),Akt通路的抑制劑Wortmannin可引起rhADAMTS13治療IR小鼠BUN,Scr水平的升高,抑制ACh誘導(dǎo)的入球小動脈舒張反應(yīng)?6)rhADAMTS13小鼠同時給予VWF,檢測結(jié)果顯示同時接受VWF?rhADAMTS13尾靜脈注射的IR組小鼠BUN,Scr較rhADAMTS13治療組顯著升高,MDA及H202表達(dá)顯著增加,SOD及CAT活性明顯下降,入球小動脈對ACh反應(yīng)明顯減弱?結(jié)論:rhADAMTS13可通過剪切VWF,抑制IR引起的氧化應(yīng)激,繼而抑制炎癥反應(yīng)?小管上皮細(xì)胞的凋亡?壞死和微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷,對缺血再灌注引起的急性腎損傷發(fā)揮保護(hù)性作用?第三部分:rhADAMTS13對缺血再灌注引發(fā)慢性腎損傷的保護(hù)性作用及機(jī)制研究目的:探討rhADAMTS13對缺血再灌注引發(fā)慢性腎損傷的保護(hù)性作用及該作用的機(jī)制?方法:1)C57BL/6小鼠缺血18分鐘后恢復(fù)灌注?術(shù)后連續(xù)3天,每天一次給予rhADAMTS13(2.6μg/kg)尾靜脈給藥?復(fù)灌后1周?1月?3月收集小鼠血液?尿液?組織標(biāo)本檢測相關(guān)指標(biāo)?2)試劑盒檢測血清BUN?Scr,24小時尿蛋白量,ELISA檢測KIM-1,及RT-qPCR檢測腎組織KIM-1,NGALmRNA水平評估腎功能損壞程度?3)PAS?MASSON?天狼猩紅染色評價腎小管損傷程度?腎小球硬化比例和間質(zhì)纖維化程度?4)免疫組化染色評價小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的嚴(yán)重程度及巨噬細(xì)胞浸潤?5)檢測氧化應(yīng)激及炎性因子,促纖維化因子在腎組織表達(dá)量?6)熒光探針檢測入球小動脈ROS的產(chǎn)生?入球小動脈體外灌注,給予血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,Ang)和ACh的梯度給藥,觀察血管收縮舒張功能?結(jié)果:1)術(shù)后1周,與sham組小鼠相比,IR小鼠受損腎小管并未完全修復(fù),腎組織KIM-1及NGALmRNA表達(dá)增高?rhADAMTS13治療IR小鼠較安慰劑給藥IR小鼠明顯好轉(zhuǎn)?rhADAMTS13治療IR小鼠尿中H202較IR組減少?2)術(shù)后1月,IR小鼠尿蛋白增加,間質(zhì)小管纖維化,KIM-1?NGAL的表達(dá)及尿中H202較sham組升高,rhADAMTS13抑制IR小鼠這些指標(biāo)的增加?四組小鼠血壓及硬化小球比例無統(tǒng)計學(xué)差異?3)術(shù)后3月,IR小鼠BUN?Scr水平輕度增高,尿蛋白增加,KIM-1及NGAL水平較高?腎臟病理表明IR組小鼠硬化腎小球比例和間質(zhì)纖維化所占的比例增加?此外,IR組小鼠MDA及H202的增加,Nrf2表達(dá)下調(diào),SOD?CAT活性下降,同時伴隨炎性因子表達(dá)的增加和腎臟巨噬細(xì)胞的浸潤?rhADAMTS13可上調(diào)IR小鼠Nrf2/HO-1,SOD2及CAT的表達(dá),增加其抗氧化應(yīng)激能力,抑制腎臟氧化應(yīng)激,炎癥反應(yīng),及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β)TGF-β/Smad3信號通路的激活,進(jìn)而抑制腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化?4)術(shù)后3月,IR組小鼠入球小動脈ROS產(chǎn)生增多?入球小動脈對AngⅡ誘導(dǎo)的血管收縮增強(qiáng),而對ACh誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)減弱?rhADAMTS13治療可抑制IR小鼠入球小動脈ROS的產(chǎn)生,改善血管收縮舒張功能障礙?結(jié)論:rhADAMTS13可通過上調(diào)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá),抑制氧化應(yīng)激?炎癥因子的產(chǎn)生,改善血管的收縮和舒張功能,進(jìn)而改善IR引起的CKD,抑制纖維化生成和腎小球硬化?

關(guān)鍵詞:ADAMTS13;VWF;缺血再灌注;氧化應(yīng)激;急慢性腎損傷;rhADAMTS13;急性腎損傷;炎癥;慢性腎臟病;

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