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摘要:子癇前期(Preeclampsia,PE),是妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders complicating pregnancy,HDCP)的特殊類型,主要特征為:妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓?蛋白尿和水腫,而分娩后血壓恢復(fù)正常?由于地理?社會?經(jīng)濟和種族?文化等的差異,不同地區(qū)發(fā)病率不同?世界范圍內(nèi),子癇前期發(fā)病率約為2%-8%,而我國子癇前期發(fā)病率偏高,約為9.4%?盡管越來越多的國家在不斷改善母嬰的健康,但每年死于妊娠相關(guān)性疾病的女性超過50萬,大約10%~15%的孕產(chǎn)婦直接死于子癇前期和子癇?子癇前期的病因及發(fā)病機理至今尚未完全闡明,目前普遍認為,滋養(yǎng)細胞在子宮螺旋動脈侵入過淺和受限是子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?滋養(yǎng)細胞是構(gòu)成胎盤結(jié)構(gòu)的主要成分,對于胎盤形成及維持胎兒正常發(fā)育起著重要作用?在囊胚植入早期,滋養(yǎng)外胚層細胞即分化為兩類滋養(yǎng)層細胞,即細胞滋養(yǎng)層細胞和合體滋養(yǎng)層細胞,前者又有兩種分化途徑:與合體滋養(yǎng)層細胞融合或分化為絨毛外滋養(yǎng)層細胞?絨毛外滋養(yǎng)層細胞具有侵襲能力,一部分絨毛外滋養(yǎng)層細胞侵潤至子宮內(nèi)膜的深層?直至子宮肌層的內(nèi)三分之一,稱為間質(zhì)滋養(yǎng)層細胞;一部分絨毛外滋養(yǎng)層細胞侵入母體子宮螺旋動脈,稱為血管內(nèi)滋養(yǎng)層細胞,并逐步取代血管內(nèi)皮及血管平滑肌細胞,引起血管基底膜降解,重塑螺旋動脈(spiral artery,SPA),形成高流?低阻SPA,以提供胎兒胎盤充足的血流量?胎盤形成過程中滋養(yǎng)細胞侵襲發(fā)生障礙,SPA侵入過淺,胎盤血流減少,一方面可引起胎兒宮內(nèi)生長受限,另一方面滋養(yǎng)細胞將分泌某些細胞因子或激素,導(dǎo)致全身血管內(nèi)皮功能損傷和炎癥反應(yīng)過度,引起高血壓?蛋白尿等一系列臨床癥狀,從而誘發(fā)子癇前期?滋養(yǎng)細胞與腫瘤細胞的浸潤過程相似,不同的是滋養(yǎng)細胞的侵襲受到精細調(diào)控,此過程涉及復(fù)雜的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,但具體的分子機制尚未被完全闡明?N-myc下游調(diào)節(jié)基因1(N-myc downstream regulatedgene 1,NDRG1),又稱為分化相關(guān)基因1(differentiation related gene I,DRGl)?應(yīng)激誘導(dǎo)應(yīng)答42(response induced by stress 42,Rit42)?氧調(diào)節(jié)蛋白1(protein regulated by oxygen-1,PROXYl)基因等,1997年在結(jié)腸癌細胞株中首次發(fā)現(xiàn)?NDRG1是一組進化過程中相對保守序列,可在多種組織中表達,參與細胞增殖?分化?缺氧及應(yīng)激反應(yīng)等多種生理功能的調(diào)節(jié)?近年來發(fā)現(xiàn)NDRG1分子在腫瘤浸潤過程中發(fā)揮重要作用,可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)表達,抑制人類多種腫瘤(前列腺癌?直腸癌?乳腺癌?胰腺癌?胃癌)細胞的轉(zhuǎn)移?體內(nèi)?外實驗研究表明NDRG1過表達可抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,而滋養(yǎng)細胞的侵蝕行為類似于腫瘤細胞?研究證實,在胎盤組織中NDRG1主要表達于滋養(yǎng)細胞,且子癇前期患者胎盤組織中NDRG1表達明顯升高,這提示NDRG1可能參與了子癇前期的發(fā)生發(fā)展?子癇前期根據(jù)發(fā)病時間可分為早發(fā)型子癇前期和晚發(fā)型子癇前期,一般發(fā)病越早,病情越嚴重?NDRG1在早發(fā)型子癇前期和晚發(fā)型癇前期是否存在差異性表達?目前尚未見報道?滋養(yǎng)細胞侵襲異常與螺旋動脈重塑障礙引起胎盤灌注減少?缺血缺氧,這是子癇前期最重要的發(fā)病機制之一,而NDRG1表達可以抑制腫瘤細胞的侵襲,因此NDRG1可能調(diào)控滋養(yǎng)細胞的侵襲過程,因此本研究通過體外實驗沉默滋養(yǎng)細胞系JEG-3中NDRG1的表達,探討細胞侵襲能力的變化?眾所周知,細胞侵襲的過程實際上是蛋白酶對組織的水解作用過程,基質(zhì)金屬蛋白酶是一類鋅依賴性蛋白水解酶,經(jīng)激活可降解大多數(shù)細胞外基質(zhì)成分?研究表明,子癇前期時子宮螺旋動脈重塑過程與基質(zhì)金屬蛋白酶表達密切相關(guān),其中MMP-2?MMP-9是滋養(yǎng)細胞侵襲過程中的限速酶?細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶MAPK家族中的一員,其異常激活與惡性腫瘤的侵襲?轉(zhuǎn)移密切相關(guān),且可上調(diào)MMP-9表達,該信號通路是否參與NDRG1的調(diào)控作用目前尚未見報道?因此,本實驗通過沉默滋養(yǎng)細胞系JEG-3中NDRG1的表達,探討NDRG1調(diào)控滋養(yǎng)細胞侵襲的分子機制?實驗?zāi)康?本研究首先通過檢測早發(fā)型子癇前期及晚發(fā)型子癇前期患者胎盤組織中NDRG1的表達變化與定位,進一步驗證NDRG1與子癇前期發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?而后通過基因沉默技術(shù)抑制滋養(yǎng)細胞NDRG1表達后觀察細胞活性?侵襲能力的改變及ERK/MMP信號通路相關(guān)蛋白表達的變化,以明確NDRG1對滋養(yǎng)細胞侵襲性的影響及在子癇前期中的作用,并探討其作用機制,為闡明子癇前期的分子機制提供線索?實驗方法:1.NDRG1在子癇前期患者胎盤中的表達(此部分內(nèi)容發(fā)表在PLACENTA雜志)選擇2014年9月到2015年3月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科定期檢查并住院分娩的子癇前期患者40例為實驗組,其中早發(fā)型子癇前期患者和晚發(fā)型子癇前期患者各20例;選擇該院同期的健康?單胎足月妊娠孕婦20例為對照組;選擇同期門診因意外妊娠?非醫(yī)學(xué)原因進行流產(chǎn)的患者20例為早孕組;孕周不足37周而無其他并發(fā)癥的20例孕婦為早產(chǎn)組?收集臨床資料(妊娠次數(shù)?孕周?蛋白尿?血壓?新生兒體重等),并于胎盤娩出后,選取胎盤胎兒面?臍帶根部周圍組織凍存,人工流產(chǎn)患者,收集其早孕絨毛組織凍存?采用免疫組織化學(xué)?實時熒光定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)和組織蛋白印跡(Western Blot)分析技術(shù),對比NDRG1在各組患者胎盤組織中的表達及定位?2.沉默NDRG1表達對JEG-3細胞侵襲的影響常規(guī)培養(yǎng)人絨毛膜癌滋養(yǎng)細胞系JEG-3細胞,實驗分為兩組:對照組與si RNA組(NDRG1基因沉默),si RNA組通過基因沉默技術(shù)抑制NDRG1表達?采用MTT實驗及流式分析技術(shù)分別檢測兩組細胞的增殖及凋亡的變化,采用Transwell實驗方法檢測細胞的侵襲能力?3.NDRG1表達影響JEG-3細胞侵襲的分子機制將人絨毛膜癌滋養(yǎng)細胞系JEG-3細胞分為兩組:對照組和si RNA組(NDRG1基因沉默),收集上述兩組細胞的培養(yǎng)液上清,采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法分析滋養(yǎng)細胞MMP-2和MMP-9分泌量的變化;分別提取兩組細胞蛋白,通過Western Blot方法檢測細胞中ERK?p-ERK?MMP-2和MMP-9表達水平的變化?實驗結(jié)果:1.一般臨床資料本實驗中對照組?早孕流產(chǎn)?早產(chǎn)?早發(fā)型子癇前期?晚發(fā)型子癇前期各組參與者在妊娠次數(shù)上無統(tǒng)計學(xué)差異?所有子癇前期患者均有高血壓和蛋白尿,早發(fā)型子癇前期組和晚發(fā)型子癇前期組收縮壓分別增加26%和40%,舒張壓分別增加了52%和39%?與對照組相比,早發(fā)型子癇前期組患者孕周縮短了14%(P<0.05),均早產(chǎn);早發(fā)型子癇前期組和晚發(fā)型子癇前期組新生兒體重分別減少54%和41%,且早發(fā)型子癇前期組的新生兒平均體重低于晚發(fā)型子癇前期組(P<0.01)?2.胎盤組織中NDRG1表達結(jié)果患者胎盤組織免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示:NDRG1表達于細胞滋養(yǎng)層細胞?合體滋養(yǎng)層細胞,在細胞間質(zhì),細胞膜和細胞質(zhì)均有著色?與足月妊娠組(對照組)相比,早孕流產(chǎn)組NDRG1表達水平較低(P<0.05),而早產(chǎn)組表達水平升高(P<0.01),早發(fā)型子癇前期組與晚發(fā)型子癇前期組NDRG1表達增多更甚,且早發(fā)型子癇前期組高于晚發(fā)型子癇前期組(P<0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義?RT-PCR及Western Blot分析結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致?值得注意的是早發(fā)型子癇前期組NDRG1 m RNA及蛋白表達水平較同孕周早產(chǎn)組明顯升高,晚發(fā)型子癇組NDRG1 m RNA及蛋白表達水平較同孕周足月妊娠組也顯著增高?3.NDRG1表達對JEG-3細胞侵襲能力的影響si RNA轉(zhuǎn)染72小時后,JEG-3細胞的NDRG1被沉默,其蛋白表達水平降低了91.14%,提示基因沉默成功?與正常對照組相比,si RNA組細胞增殖活性及凋亡比例無明顯變化?然而Transwell實驗結(jié)果顯示:NDRG1基因沉默后,穿過Matrigel遷移至濾膜下的細胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)?4.NDRG1對JEG-3細胞中ERK/MMPs表達的影響ELISA檢測si RNA細胞培養(yǎng)上清中MMP-2和MMP-9的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,si RNA組細胞上清中MMP-2表達增加了101.2%,MMP-9表達增加了65.01%,對比具有顯著差異?Western Blot結(jié)果顯示:NDRG1基因沉默使JEG-3細胞MMP-2的相對表達量增加了53.7%,MMP-9的相對表達量增加了48.83%?ERK1和ERK2總表達水平與正常對照無統(tǒng)計學(xué)差異,但p-ERK1和p-ERK2總蛋白水平較對照組增加了61%,差異顯著?實驗結(jié)論:1.NDRG1在妊娠早期表達水平較低,隨妊娠時間增加,表達水平增加?2.在子癇前期的胎盤組織中,尤其是早發(fā)型子癇前期,NDRG1表達水平顯著增加?3.沉默NDRG1的表達,增強了JEG-3細胞的侵襲能力?4.NDRG1通過ERK/MMP-2/9信號通路影響滋養(yǎng)細胞的侵襲,可能是人類子癇前期發(fā)生的分子調(diào)控機制之一。
關(guān)鍵詞：NDRG1; 子癇前期; 滋養(yǎng)細胞; 侵襲;
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