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摘要：第一部分 lncRNATUG1在腦組織缺血再灌注損傷中的作用背景:近年來,隨著我國人民的生活水平的提高和人口老齡化,缺血性腦卒中發(fā)病率越來越高,成為我國人民死亡的主要原因。而我們在臨床上也發(fā)現(xiàn)當缺血性腦卒中恢復(fù)血液灌注時,其損傷程度將更為嚴重。研究表明腦缺血后發(fā)生在缺血半暗帶的過度的炎癥反應(yīng)是造成繼發(fā)性腦損傷的主要原因:抑制炎癥介質(zhì)的過度表達可以減輕腦缺血后繼發(fā)性腦損傷,而激發(fā)抗炎信號通路則可能加重繼發(fā)性腦損傷。如何有效地保護大腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CRI)成為擺在我們面前的一道難題。而近期不斷有研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在心腦血管保護的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究的目的是利用星形膠質(zhì)細胞(astrocyte,AS)系缺氧/復(fù)氧(oxygen deficit/reoxygenation,OGD/RX),研究 lncRNA ?；撬嵘险{(diào)基因 1(taurine upregulated gene 1,TUG1)與CRI的關(guān)系。方法:通過培養(yǎng)小鼠AS系MA-C細胞(購自北京冬哥生物科技有限公司)進行實驗,建立OGD/RX模型,分成四組:正常對照,低氧6h/復(fù)氧6h組,低氧6h/復(fù)氧24h組,低氧6h/復(fù)氧48h組。利用定量實時聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)測量 lncRNATUG1 的表達,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測細胞損傷程度和流式細胞儀檢測細胞的凋亡程度,比較以上四組lncRNA TUG1之間的差異,并進一步發(fā)掘lncRNA TUG1在保護大腦缺血再灌注損傷中的作用。利用三種不同小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾lncRNATUG1的表達,顯示lncRNATUG1的腦保護作用還是否存在。結(jié)果:RT-PCR檢測,結(jié)果提示OGD/RX后,lncRNA TUG1表達明顯上升(P<0.05)。LDH檢測結(jié)果顯示lncRNATUG1 siRNA對OGD引起損傷有保護作用(P<0.05)。流式細胞儀檢測細胞凋亡檢測說明lncRNATUG1 siRNA干預(yù)后,細胞凋亡明顯減少(P<0.05)。結(jié)論:lncRNA TUG1在OGD/RX后起重要作用,它能加劇細胞的凋亡,如果抑制lncRNATUG1的表達,細胞凋亡數(shù)量將明顯減少。第二部分 lncRNATUG1通過調(diào)控AQP4發(fā)揮作用目的:考慮到我們之前研究發(fā)現(xiàn)AQP4在CRI中發(fā)揮重要作用,我們猜測lncRNA TUG1是否通過調(diào)控AQP4發(fā)揮作用。方法:我們利用AS系siRNA成功干擾AQP4的表達后,建立OGD/RX模型,然后分別用untreated、TUG1 siRNA處理,觀察TUG1對細胞的損傷作用是否存在。用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot,WB)檢測TUG 1 siRNA干擾后,AQP4的表達情況。并用AQP4 siRNA干擾AQP4的作用,檢測AQP4受干擾后,細胞LDH濃度是否改變。流式細胞儀檢測細胞凋亡,檢測AQP4受干擾后,TUG1有沒有進一步對細胞的損傷作用。結(jié)果:WB結(jié)果顯示TUG1 siRNA干擾后AQP4的表達下降(P<0.05)。AQP4的作用受干擾后,LDH結(jié)果顯示TUG1的作用消失,流式細胞儀結(jié)果顯示AQP4受干擾后,TUG1沒有進一步對細胞的損傷作用。結(jié)論:lncRNATUG1對細胞的損傷作用是通過AQP4的表達變化來實現(xiàn)。第三部分 lncRNA TUG1調(diào)控AQP4的機制——通過吸附miR-145的表達目的:檢測TUG1對AS的損傷作用的調(diào)控是否通過吸附miR-145來調(diào)控AQP4的表達而實現(xiàn)。方法:我們用Starbase軟件預(yù)測TUG1與miR-145結(jié)合位點;用RT-PCR檢測TUG1 siRNA 轉(zhuǎn)染前后,miR-145 表達變化;用 miR-145(mimics 和 inhibitor)處理 AS細胞,觀察處理前后AQP4的表達變化。AS用miR-]45 inhibitor預(yù)處理后,然后分別用untreated和TUG1 siRNA 1處理(inhibitor預(yù)處理的細胞,培養(yǎng)24小時后再用TUG1 siRNA轉(zhuǎn)染6小時),建立OGD/RX模型觀察TUG1 siRNA對細胞的保護作用是否存在。LDH檢測,先用miR-145inhibitor處理后,建立OGD/RX模型,觀察損傷是否加重;再用TUG1 siRNA處理,觀察TUG1 siRNA的保護作用是否還存在。流式細胞儀檢測凋亡,miR-145 inhibitor處理后,再用TUG1 siRNA處理,siTUG1的保護作用是否存在;AS用TUG1 siRNA 1成功干擾后,然后分別用untreated和miR-145 inhibitor處理(TUG1 siRNA預(yù)處理的細胞,培養(yǎng)6小時再用miR-145 inhibitor處理6h),建立OGD/RX模型,觀察TUG1 siRNA對細胞的保護作用是否還存在。LDH檢測結(jié)果顯示,TUG1干擾后,細胞損傷是否減輕;再用miR-145 inhibitor作用,觀察保護作用是否消失。結(jié)果:(1)在正常情況下,WB結(jié)果顯示miR-145可以介導(dǎo)AQP4表達的調(diào)控作用,當miR-145表達上升時,AQP4的表達下降(P<0.001),當miR-145表達受到抑制時,AQP4的表達升高(P<0.001)。(2)在OGD/RX后,WB結(jié)果顯示與正常對照組相比AS細胞中AQP4表達明顯增加(P<0.01),而添加miR-145后,AQP4的表達顯著降低(P<0.001),而抑制miR-145的作用后,AQP4的表達升高,甚至明顯高于未干預(yù)的OGD/RX后的AQP4表達(P<0.01)。(3)在正常情況下,我們通過RT-PCR結(jié)果顯示TUG1也可以介導(dǎo)miR-145的表達,當TUG1的作用受到干擾時,miR-145的表達升高(P<0.05)。(4)LDH檢測細胞毒性實驗顯示,OGD/RX后細胞中的LDH含量與正常對照組相比明顯升高(P<0.01),而添加miR-145 inhibit后,細胞中的LDH與未添加的OGD/RX后的細胞相比進一步升高,并添加siTUG1后,細胞中的LDH無明顯變化。(5)流式細胞儀結(jié)果顯示:與正常對照組相比,OGD/RX后,細胞的凋亡率明顯增加(P<0.001),OGD/RX+miR-145 inhibitor處理后,細胞的凋亡率進一步增加(P<0.01)。而添加了 miR-145 inhibitor的OGD/RX細胞后,再添加siTUG1后,細胞的凋亡率無明顯改變。但如果未添加miR-145 inhibitor的OGD/RX細胞,添加siTUG1后,細胞的凋亡率明顯下降(P<0.01)。結(jié)論:lncRNA TUG1和AQP4的表達介導(dǎo)OGD/RX后AS細胞的損傷和凋亡是通過miR-145的調(diào)控而實現(xiàn)的。第四部分 體內(nèi)實驗證實lncRNATUG1參與調(diào)控CRI損傷目的:通過對C57/BL6雄性小鼠進行和小鼠大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型實驗,模擬大腦缺血再灌注損傷,觀察TUG1是否參與CRI損傷。方法:將C57/BL6雄性小鼠分成假手術(shù)組,MCAO組,MCAO+Negative shRNA組和MCAO+TUG1 shRNA組。通過計算腦梗死區(qū)域的面積,神經(jīng)功能學(xué)評分和TUNEL染色來證實TUG1是否參與調(diào)控大腦缺血缺氧再灌注損傷。結(jié)果:(1)小鼠MCAO后梗死面積增加,側(cè)腦室注射Negative shRNA后梗死面積無明顯改變,但側(cè)腦室注射TUG1 shRNA后梗死面積顯著減少(P<0.01)。(2)小鼠MCAO后,bederson評分與假手術(shù)組相比非常顯著增加(P<0.001),而側(cè)腦室注射Negative shRNA后,bederson評分與MCAO組相比無明顯差異,而側(cè)腦室注射TUG1 shRNA后,bederson評分明顯下降(P<0.01)。(3)小鼠MCAO后,與假手術(shù)組相比,細胞凋亡數(shù)顯著增加(P<0.01),而側(cè)腦室注射Negative shRNA后,細胞凋亡數(shù)與MCAO組無明顯差異,然而側(cè)腦室注射TUG1 shRNA后,細胞凋亡數(shù)顯著較少(P<0.001)。結(jié)論:當發(fā)生CRI時,TUG1的作用受到干擾后,可以保護AS細胞免受缺血缺氧再灌注損傷。
關(guān)鍵詞：lncRNA; TUG1; OGD/RX; 腦保護; 缺血再灌注; AQP4; 星形膠質(zhì)細胞; 缺血再灌注損傷; miR-145; MCAO; shRNA;
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