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摘要:背景及目的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一種多系統(tǒng)累及的自身免疫性疾病,狼瘡腎炎(Lupus Nephritis,LN)則是SLE最常見?最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,是影響預(yù)后的重要因素?在SLE中約有50-70%的患者在確診后5年內(nèi)累及腎臟,5-15%的患者最終在10年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎臟病?自從糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑應(yīng)用于LN的治療以來,緩解率明顯增高,但6個月的完全緩解率仍不足10%,3年完全緩解率僅約60%?由此可見,LN的預(yù)后仍不容樂觀,加之,SLE主要影響育齡期女性,往往給社會?家庭帶來了極大的痛苦與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此對LN機(jī)制研究并尋找新的靶向治療非常必要及緊迫?自噬是在膜包囊泡中通過溶酶體降解胞質(zhì)內(nèi)容物的一種生物學(xué)過程,主要對受損細(xì)胞器和老化蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解,為機(jī)體提供合成新的蛋白質(zhì)和更新細(xì)胞器所需的原料,從而維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定?自噬異常可導(dǎo)致腫瘤?心血管疾病?肝病以及自身免疫性疾病等?一些自噬與SLE關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn),與健康人以及非SLE自身免疫病(血管炎和干燥綜合征)患者相比,SLE患者T淋巴細(xì)胞自噬水平升高?自噬基因Atg5缺陷會影響B細(xì)胞的發(fā)育?用3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素阻斷轉(zhuǎn)染黏蛋白1的樹突狀細(xì)胞內(nèi)自噬途徑,可抑制特異性CD4+T細(xì)胞增殖?目前研究認(rèn)為,自噬可能通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞?B淋巴細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞?巨噬細(xì)胞從而在SLE的發(fā)病環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用?既往自噬與SLE的研究主要集中在免疫細(xì)胞,但是當(dāng)SLE累及腎臟,自噬是否也對腎臟固有細(xì)胞存在調(diào)控作用?自噬本身是否參與狼瘡腎炎的發(fā)生發(fā)展?目前沒有直接的證據(jù),只有一些間接的研究結(jié)果可供參考,例如:Hartleben et al.通過敲除小鼠的自噬相關(guān)基因Atg5后,小鼠出現(xiàn)了蛋白尿?腎小球硬化以及腎臟足細(xì)胞的丟失?應(yīng)用從SLE患者血液中分離的ds-DNA抗體刺激足細(xì)胞,足細(xì)胞的胞質(zhì)發(fā)生抗體聚集現(xiàn)象,并且引發(fā)足細(xì)胞損傷,自噬抑制劑干預(yù)可造成胞內(nèi)抗體堆積增加,由此表明自噬可能參與了足細(xì)胞內(nèi)抗體的消減以及足細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)?基于此背景,本課題在細(xì)胞學(xué)及動物學(xué)研究基礎(chǔ)上,采用電鏡?免疫組化?western blot?qRT-PCR等方法檢測狼瘡腎炎病程中自噬的表達(dá),評估自噬變化的趨勢,進(jìn)一步探討自噬被干預(yù)后足細(xì)胞的生存狀態(tài)?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)及狼瘡鼠的尿蛋白情況,從而評估自噬對于疾病的影響,最后通過MyD88-siRNA阻斷TLRs/NF-κ B通路后檢測自噬及足細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá),揭示自噬激活的通路和調(diào)控機(jī)制?方法及結(jié)果1.自噬在狼瘡腎炎腎組織及足細(xì)胞中的表達(dá)分析我們應(yīng)用電鏡?qRT-PCR和免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎組腎臟和腎小球足細(xì)胞LC3和Beclin1表達(dá)高于正常組(P<0.05),同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)反應(yīng)自噬降解的指標(biāo)SQSTM1/p62也表達(dá)升高?應(yīng)用狼瘡患者IgG處理足細(xì)胞,分別予巴弗洛霉素及Atg5-siRNA干預(yù)白噬后,通過western blot?qRT-PCR以及串聯(lián)RFP-GFP-LC3腺病毒等檢測,發(fā)現(xiàn)24h?48h及72h不同時(shí)間段LC3?Beclin1以及p62的表達(dá)均增高,表明自身抗體激活了足細(xì)胞的自噬,但激活的自噬存在降解障礙?2.自噬在狼瘡腎炎足細(xì)胞損傷中的作用分析應(yīng)用LNIgG孵育足細(xì)胞,雷帕霉素及Atg5-siRNA干預(yù)自噬后,western blot檢測發(fā)現(xiàn)狼瘡IgG誘導(dǎo)足細(xì)胞標(biāo)志物Nephrin?CD2AP表達(dá)下降;較之LNIgG組,沉默自噬基因Atg5引起Nephrin和CD2AP的表達(dá)減低明顯;與之相反,雷帕霉素干預(yù)后Nephrin?CD2AP表達(dá)較LNIgG組增加?流式分析表明,Atg5-siRNA促進(jìn)足細(xì)胞的凋亡,然而,雷帕霉素減輕了足細(xì)胞凋亡的發(fā)生?動物學(xué)研究再次證明雷帕霉素處理狼瘡小鼠后尿蛋白量明顯減少,Atg5-siRNA干預(yù)后尿蛋白量明顯加重,western blot檢測發(fā)現(xiàn),對比狼瘡組,雷帕霉素+LN組腎臟Nephrin?CD2AP表達(dá)增高,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白指標(biāo)GRP94表達(dá)減低,Atg5-siRNA+LN組Nephrin?CD2AP表達(dá)減低,GRP94表達(dá)增高?由此推測,自噬可以保護(hù)足細(xì)胞并抑制狼瘡腎炎病情進(jìn)展?3.狼瘡腎炎中激活自噬的NF-K B通路分析狼瘡IgG處理足細(xì)胞后,經(jīng)western blot檢測發(fā)現(xiàn),Atg5-siRNA干預(yù)導(dǎo)致MyD88及nucleus NF-κB p65的表達(dá)增加,故自噬可以抑制狼瘡腎炎NF-κB通路相關(guān)炎癥反應(yīng)?隨后western blot檢測到,與LN組相比,MyD88-siRNA干預(yù)后的足細(xì)胞Nephr in和CD2AP表達(dá)增加,說明阻斷MyD88可以減輕抗體誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷?最后,我們發(fā)現(xiàn)在抗體誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中,MyD88阻斷后足細(xì)胞自噬表達(dá)減低,說明自噬可能通過TLRs/NF-κ B通路介導(dǎo)激活,并負(fù)反饋抑制TLRs/NF-κ B相關(guān)炎癥反應(yīng)?結(jié)論狼瘡腎炎腎臟組織中存在自噬的增強(qiáng),狼瘡IgG誘導(dǎo)足細(xì)胞的異常自噬增強(qiáng),也造成了足細(xì)胞的損傷;通過干預(yù)自噬后評估足細(xì)胞生存狀態(tài)及狼瘡小鼠的病情變化,我們發(fā)現(xiàn)自噬發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞和腎臟的作用?狼瘡抗體誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,自噬可以抑制細(xì)胞中過高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)來保護(hù)足細(xì)胞?在抗體誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中,自噬可能通過MyD88介導(dǎo)的TLRs/NF-κ B通路而被激活,從而負(fù)性調(diào)控TLRs/NF-κ B相關(guān)的炎癥反應(yīng)來保護(hù)足細(xì)胞?自噬的調(diào)控可能是未來治療狼瘡腎炎的有效手段,也是預(yù)防狼瘡腎炎發(fā)生的有效措施?

關(guān)鍵詞：自噬; 足細(xì)胞; 狼瘡腎炎;

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