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背景：

急性肺損傷（ALI）是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，其特征是由各種肺部疾病過程引起的肺水腫和炎癥，通常需要機(jī)械通氣和皮質(zhì)類固醇治療。盡管ALI 的治療方法取得了很大的進(jìn)步，但其死亡率依然較高，易發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征。到目前為止，ALI 的有效治療方法依然相對(duì)有限。努力發(fā)現(xiàn)新的治療藥物，阻斷ALI 的進(jìn)展一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。連翹脂素是中藥連翹的活性成分之一，屬于木脂素類成分，目前已被納入中藥連翹的指紋成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)連翹脂素具有良好的抗炎活性，不斷有學(xué)者通過RAW264.7 細(xì)胞、BEAS-2B 細(xì)胞、L02 細(xì)胞等體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，且其抗炎作用可能是通過多靶點(diǎn)和多途徑實(shí)現(xiàn)的。但是，連翹脂素對(duì)體內(nèi)抗炎活性研究方面的報(bào)道還相對(duì)比較缺乏。關(guān)于連翹脂素對(duì)ALI 的保護(hù)作用也鮮見報(bào)道。因此，本課題擬從整體動(dòng)物、組織器官和細(xì)胞分子水平，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接等現(xiàn)代研究手段，對(duì)連翹脂素的抗炎作用和抗ALI 機(jī)理進(jìn)行深入研究。在進(jìn)行抗ALI 作用研究之前，本課題首先對(duì)連翹脂素的藥理活性從毒理、量效關(guān)系、副作用、鎮(zhèn)痛、抗炎機(jī)制等方面進(jìn)行一個(gè)比較系統(tǒng)的研究，然后聚焦到具體的急性炎癥模型----急性肺損傷上來進(jìn)一步闡明連翹脂素的活性，以期為連翹脂素的體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用提供開發(fā)應(yīng)用依據(jù)。

研究方法：

（1）連翹脂素的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究：采用最大給藥量法，小鼠單次口服灌胃連翹脂素5 g/kg，觀察小鼠出現(xiàn)的反應(yīng)。

（2）評(píng)價(jià)連翹脂素的抗炎鎮(zhèn)痛作用，并觀察連翹脂素的不良反應(yīng)：以二甲苯致小鼠耳腫脹和λ-角叉菜膠致小鼠足腫脹兩種動(dòng)物模型進(jìn)行連翹脂素抗炎作用研究。采用扭體法、熱板法、甩尾法三種小鼠模型考察連翹脂素的鎮(zhèn)痛作用。同時(shí)考察連翹脂素對(duì)正常小鼠體溫的影響，排除其不良反應(yīng)。初步觀察連翹脂素對(duì)凝血系統(tǒng)的影響，通過剪尾法和毛細(xì)血管法考察連翹脂素對(duì)體內(nèi)出血和凝血時(shí)間的影響，檢測(cè)小鼠凝血四項(xiàng)并取人正常血漿測(cè)定體外凝血四項(xiàng)。

（3）連翹脂素對(duì)LPS 聯(lián)合人正常血漿誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞炎癥損傷的作用及機(jī)制研究：通過 LPS 聯(lián)合人正常血漿（NHP）誘導(dǎo)A549 細(xì)胞建立體外炎癥損傷模型。通過ELISA 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的變化觀察連翹脂素對(duì)細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)連翹抗ALI 關(guān)鍵靶標(biāo)和信號(hào)通路，并與連翹脂素進(jìn)行分子對(duì)接；運(yùn)用免疫熒光、qRT-PCR 和Western blot 檢測(cè)連翹脂素作用后以上關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)情況。

（4）連翹脂素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI 的作用及機(jī)制研究：將小鼠分為空白、模型、陽性藥地塞米松組、連翹脂素25 和12.5 mg/kg 組。HE 染色觀察肺組織病理變化；計(jì)支氣管肺泡灌洗液（BALF）白細(xì)胞數(shù)目和蛋白濃度，并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量；ELISA 和qRT-PCR 檢測(cè)炎癥介質(zhì)的蛋白和基因表達(dá)變化；并采用免疫組化、免疫熒光、qRT-PCR、Western blot 和透射電鏡對(duì)關(guān)鍵通路的基因和蛋白進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

研究結(jié)果：

（1）連翹脂素5 g/kg 灌胃給藥后未出現(xiàn)小鼠死亡，未見明顯毒性反應(yīng)。連翹脂素灌胃給藥后對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹、角叉菜膠所致足腫脹顯示出良好的對(duì)抗作用；對(duì)小鼠足腫脹組織白細(xì)胞增多具有抑制效應(yīng)，并抑制NF-κB 通路的激活；鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連翹脂素可顯著減少小鼠扭體次數(shù)并延長(zhǎng)小鼠疼痛潛伏期和痛閾值；連續(xù)給予不同劑量的連翹脂素（6.25、12.5、25 mg/kg）后，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肛溫?zé)o明顯變化；連翹脂素6.25-100 mg/kg 范圍內(nèi)小鼠體內(nèi)出血時(shí)間、凝血時(shí)間和體內(nèi)外凝血四項(xiàng)均無顯著變化。

（2）連翹脂素對(duì)LPS 聯(lián)合人正常血漿誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞炎癥損傷模型的保護(hù)作用及機(jī)制研究：A549 細(xì)胞受1 μg/mL LPS 聯(lián)合5%NHP 刺激后，未見細(xì)胞活力明顯下降及凋亡現(xiàn)象，炎癥介質(zhì)含量顯著增加，核內(nèi)NF-κB p65 熒光強(qiáng)度顯著增加，模型成立；連翹脂素干預(yù)細(xì)胞后可以降低細(xì)胞中炎癥因子、趨化因子和黏附分子的表達(dá)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接結(jié)果顯示連翹脂素可能通過作用于凋亡、MAPK、NF-κB、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)、JAK-STAT 信號(hào)通路改善ALI；體外細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連翹脂素可以顯著降低補(bǔ)體C3、C5a 和C5aR1（CD88）的表達(dá)，p65 核內(nèi)熒光強(qiáng)度及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，p38、JNK 和EKR 的磷酸化水平及JAK2/STAT3的基因和蛋白表達(dá)。

（3）連翹脂素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI 的保護(hù)作用及機(jī)制研究結(jié)果顯示，連翹脂素可以顯著降低BALF 中蛋白含量和白細(xì)胞數(shù)目，改善肺組織病理病變，降低肺組織、BALF 和血清中炎癥介質(zhì)的表達(dá)；qRT-PCR 結(jié)果表明連翹脂素可以降低肺組織中補(bǔ)體成分C3、C6、fB 和補(bǔ)體受體CD88 表達(dá)；免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示連翹脂素下調(diào)補(bǔ)體C3、C5b-9 和C5a、CD88 蛋白表達(dá)；qRT-PCR、免疫組化和Western blot 結(jié)果顯示連翹脂素可以改善TLR4-MyD88-IKKβ-IκBα-p65 的表達(dá)，降低p65 磷酸化水平；抑制MAPK、JAK2/STAT3 及線粒體凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)；透射電鏡結(jié)果顯示連翹脂素明顯減輕肺組織線粒體損傷。

結(jié)論：

連翹脂素具有良好的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，連翹脂素能夠通過減輕LPS 誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷，抑制肺組織炎癥反應(yīng)，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥介質(zhì)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)LPS 致急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用，其作用機(jī)理與抑制LPS-C5a-C5aR1 和LPS/TLR4信號(hào)通路進(jìn)而抑制NF-κB、MAPK 和JAK2-STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化密切相關(guān)。

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