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背景:副溶血弧菌是海產(chǎn)品相關(guān)性食物中毒的首要病原菌,能表達(dá)多種毒力因子并具有很強(qiáng)的生物膜形成能力。QsvR是Ara C家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,對(duì)副溶血弧菌毒力、生物膜形成、運(yùn)動(dòng)性等都具有調(diào)控作用。環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)是普遍存在于細(xì)菌中的一種第二信使,對(duì)生物膜形成、毒力、運(yùn)動(dòng)性等均有調(diào)控作用。QsvR對(duì)副溶血弧菌中c-di-GMP代謝的調(diào)控機(jī)制也需要進(jìn)一步研究。目的:利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)(RNA-seq)方法探究QsvR的調(diào)控元,并進(jìn)一步研究QsvR調(diào)控c-di-GMP代謝的分子機(jī)制。方法:采用生物膜結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)分析QsvR對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的調(diào)控作用。采用RNA-seq分析生物膜形成條件下WT和qsvR突變株(ΔqsvR)的差異表達(dá)基因;利用實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,qPCR)實(shí)驗(yàn)、lux報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果并分析QsvR對(duì)c-di-GMP代謝相關(guān)基因的調(diào)控關(guān)系;構(gòu)建若干與c-di-GMP代謝相關(guān)的基因突變株,利用透明度實(shí)驗(yàn)、結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)、cdi-GMP濃度測(cè)定、swimming和swarming表型實(shí)驗(yàn)初步探究c-di-GMP代謝相關(guān)基因的功能。結(jié)果:生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明WT和ΔqsvR在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致,表明QsvR不影響副溶血弧菌生長(zhǎng)。生物膜結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同培養(yǎng)時(shí)間(24 h和48 h)下,ΔqsvR的生物膜形成量均高于WT的,表明QsvR抑制生物膜的形成。RNA-seq結(jié)果表明,相較于野生株,ΔqsvR中共存在1735個(gè)差異表達(dá)基因,其中880個(gè)基因表達(dá)上調(diào),855個(gè)基因表達(dá)下調(diào);GO富集共注釋到三個(gè)一級(jí)分類,包括30個(gè)富集最顯著的二級(jí)分類;1735個(gè)差異表達(dá)基因被歸類至6類KEGG通路;1483個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到21個(gè)COG功能分類;差異表達(dá)基因中包含:16個(gè)胞外多糖合成相關(guān)基因(14個(gè)上調(diào)、2個(gè)下調(diào))、19個(gè)莢膜多糖合成相關(guān)基因(均下調(diào))、15個(gè)Ⅳ型菌毛相關(guān)基因(均下調(diào))、35個(gè)極鞭毛合成相關(guān)基因(除flg A外,其余均下調(diào))、16個(gè)側(cè)鞭毛合成相關(guān)基因(7個(gè)下調(diào)、9個(gè)上調(diào))以及24個(gè)c-di-GMP代謝相關(guān)基因(11個(gè)下調(diào)、13個(gè)上調(diào))。qPCR和lux報(bào)告基因基因融合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RNA-seq結(jié)果的可靠性。c-di-GMP濃度測(cè)定顯示,不同的培養(yǎng)時(shí)間(24h和48h)下,ΔqsvR中的c-di-GMP濃度均低于WT中的,表明QsvR促進(jìn)副溶血弧菌中c-di-GMP的合成;EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示QsvR可直接結(jié)合到19個(gè)c-di-GMP代謝相關(guān)基因的上游啟動(dòng)子區(qū)而直接調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄。此外,VP0117、VPA0198和VP2979均是推定的和c-diGMP代謝有關(guān)的基因,因此本研究構(gòu)建了vp0117突變株(Δvp0117)、VP0117的EAL結(jié)構(gòu)域突變株(Δvp0117-EAL)、VP0117的GGDEF結(jié)構(gòu)域突變株(Δvp0117-GGDEF)、vpa0198突變株(Δvpa0198)和vp2979突變株(Δvp2979),進(jìn)而分析它們對(duì)生物膜相關(guān)表型的影響。結(jié)果顯示,Δvp0117和Δvp0117-EAL的生物膜形成量均高于WT的,表明VP0117抑制生物膜的形成;c-di-GMP濃度測(cè)定表明VP0117抑制副溶血弧菌細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP的合成;Δvp0117、Δvp0117-EAL及Δvp0117-GGDEF的爬動(dòng)能力與WT的相當(dāng),而Δvp0117和Δvp0117-EAL泳動(dòng)能力受到抑制;透明度實(shí)驗(yàn)表明VP0117不影響副溶血弧菌莢膜多糖的產(chǎn)生。相比之下,VP2979和VPA0198不影響副溶血弧菌的c-di-GMP合成、莢膜多糖合成以及生物膜形成,但二者均抑制爬動(dòng)能力;此外VP2979抑制泳動(dòng)能力。結(jié)論:QsvR是副溶血弧菌的一個(gè)全局調(diào)控子,控制大量基因的表達(dá),這些基因涉及眾多細(xì)胞通路。在生物膜形成條件下,QsvR直接調(diào)控許多c-di-GMP代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,從而并促進(jìn)c-di-GMP的合成。

微生物環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）ELISA 試劑盒                 武漢默沙克生物科技有限公司