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副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范圍內(nèi)引起海產(chǎn)品相關(guān)食物中毒的主要致病菌，具有很強(qiáng)的生物膜形成能力。ToxR是一種膜結(jié)合調(diào)控蛋白，對副溶血弧菌生物膜形成具有一定的調(diào)控作用，但具體機(jī)制尚未見報道。c-di-GMP是一種普遍存在于細(xì)菌中重要的第二信使，參與調(diào)控細(xì)菌的多種生物學(xué)行為包括生物膜的形成。本文探究ToxR對副溶血弧菌中c-di-GMP代謝的調(diào)控作用。利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測定副溶血弧菌野生株(wild-type, WT)和toxR突變株(ΔtoxR)中c-di-GMP水平的差異。挑選c-di-GMP代謝相關(guān)基因scrA、scrG和vpa0198為進(jìn)一步研究的靶標(biāo)，采用實(shí)時定量qPCR實(shí)驗(yàn)檢測靶基因在WT和ΔtoxR中的轉(zhuǎn)錄水平差異；將靶基因調(diào)控區(qū)DNA序列克隆入pHRP309質(zhì)粒中無啟動子的β半乳糖苷酶基因上游，采用lacZ報告基因融合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究ToxR對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系；將重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100λpir中，采用lacZ報告基因融合實(shí)驗(yàn)研究ToxR是否能在異體宿主中調(diào)控靶基因的表達(dá)；PCR擴(kuò)增靶基因上游調(diào)控區(qū)DNA序列，并純化His-ToxR蛋白，用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)研究His-ToxR與靶基因啟動子區(qū)DNA序列是否具有結(jié)合作用。ELISA結(jié)果顯示ΔtoxR中c-di-GMP含量顯著性高于WT中的，說明ToxR抑制c-di-GMP的產(chǎn)生；實(shí)時定量qPCR結(jié)果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的轉(zhuǎn)錄水平顯著性高于ΔtoxR中的，表明ToxR抑制它們的轉(zhuǎn)錄；lacZ報告基因融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100λpir中scrA、scrG和vpa0198的啟動子區(qū)活性；EMSA實(shí)驗(yàn)顯示His-ToxR能特異性地結(jié)合到scrA和scrG的上游調(diào)控區(qū)DNA序列上，而對vpa0198的上游調(diào)控區(qū)DNA序列無結(jié)合作用。綜上所述，ToxR通過直接調(diào)控相關(guān)酶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄來抑制副溶血弧菌內(nèi)c-di-GMP的合成，從而有助于精確調(diào)控生物膜形成等細(xì)菌行為。

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