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背景:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)形成成熟的生物膜需要一些特定的結(jié)構(gòu),包括胞外多糖、IV型菌毛和莢膜多糖,并受到密度感應(yīng)和環(huán)二鳥苷酸(cdi-GMP)等各種調(diào)控通路的嚴格調(diào)控。Qsv R是一種Ara C型調(diào)控子,通過直接調(diào)控密度感應(yīng)系統(tǒng)核心調(diào)控子Aph A和Opa R的轉(zhuǎn)錄整合到密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控級聯(lián)中。在野生型或opa R突變背景下,qsv R的缺失改變了副溶血弧菌生物膜的形成能力,提示Qsv R可能與Opa R協(xié)同控制生物膜的形成。目的:探究Qsv R和Opa R對副溶血弧菌生物膜形成的聯(lián)合調(diào)控作用方法:采用生物膜結(jié)晶紫染色和菌落褶皺實驗來探究Qsv R和Opa R對生物膜形成的調(diào)控是否具有相互作用;采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗測定菌體的胞內(nèi)c-di-GMP濃度,分析Qsv R和Opa R對副溶血弧菌c-di-GMP合成的共同調(diào)控作用;通過透明度實驗來探究Qsv R和Opa R對副溶血弧菌菌落透明度變化的共同調(diào)控作用。選取胞外多糖相關(guān)基因cps A和scv E、Ⅳ型菌毛相關(guān)基因pli A和msh B、c-di-GMP代謝相關(guān)基因scr A和scr G、莢膜多糖相關(guān)基因VP0218和VP0219作為靶基因,運用q PCR和Lac Z報告基因融合實驗來分析Qsv R和Opa R對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控關(guān)系;運用雙質(zhì)粒報告基因?qū)嶒灪虴MSA來探究Qsv R和Opa R在大腸桿菌及體外條件下對靶基因轉(zhuǎn)錄是否具有直接的調(diào)控作用。結(jié)果:生物膜結(jié)晶紫染色和菌落褶皺實驗顯示Δqsv R/p BAD33、Δopa R/p BAD33和Δqsv RΔopa R/p BAD33形成更多的生物膜,產(chǎn)生更褶皺的菌落形態(tài),并且Δqsv R/p BAD33-opa R和Δopa R/p BAD33-qsv R能夠回補Δqsv R/p BAD33和Δopa R/p BAD33的生物膜產(chǎn)生量以及褶皺的菌落形態(tài),表明Qsv R和Opa R共同抑制副溶血弧菌的生物膜形成,并且二者具有相互回補的作用。酶聯(lián)免疫吸附實驗顯示Δqsv R/p BAD33、Δopa R/p BAD33和Δqsv RΔopa R/p BAD33產(chǎn)生更多的c-diGMP,并且Δqsv R/p BAD33-opa R和Δopa R/p BAD33-qsv R的c-di-GMP產(chǎn)生量可以恢復(fù)到WT/p BAD33水平,表明Qsv R和Opa R共同抑制胞內(nèi)c-di-GMP的合成,并且二者具有相互回補的作用。透明度實驗顯示Δqsv R/p BAD33、Δopa R/p BAD33和Δqsv RΔopa R/p BAD33菌株產(chǎn)生透明的菌落,而WT/p BAD33、C-Δqsv R、Δqsv R/p BAD33-opa R、C-Δopa R和Δopa R/p BAD33-qsv R的菌落為不透明狀態(tài),表明Qsv R和Opa R共同調(diào)控菌落透明度從不透明到透明之間的轉(zhuǎn)化;分子實驗表明Opa R直接抑制cps A和scv E的轉(zhuǎn)錄,而Qsv R對它們的轉(zhuǎn)錄沒有調(diào)控作用;Qsv R和Opa R均能夠直接促進msh A1、pil A、scr G、VP0218和VP0219的轉(zhuǎn)錄,并且二者具有互補作用。Opa R直接而Qsv R間接抑制scr A的轉(zhuǎn)錄。競爭性EMSA實驗表明,His-Qsv R和His-Opa R與靶基因啟動子區(qū)DNA的結(jié)合不具有競爭作用。總之,Qsv R和Opa R協(xié)同抑制生物膜相關(guān)表型和c-di-GMP代謝,促進副溶血弧菌形成不透明菌落。Qsv R能夠恢復(fù)opa R突變引起的生物膜相關(guān)表型變化,反之亦然。Qsv R和Opa R協(xié)同調(diào)控胞外多糖生成相關(guān)基因、IV型菌毛相關(guān)基因、莢膜多糖合成相關(guān)基因以及c-di-GMP代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:Qsv R和Opa R協(xié)同抑制副溶血弧菌的生物膜形成能力,二者可以相互彌補基因突變后的表型缺陷,但沒有疊加效應(yīng);Qsv R和Opa R通過直接調(diào)控生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控生物膜形成。
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